Última actualización: 28 de septiembre de 2022
Procedimiento
- En una jeringa de 50 ml de capacidad poner 7 ml de anticoagulante A y en otra de 20 ml de capacidad poner 1,5 ml de anticoagulante B.
Extraer, mediante una palomita de 19 G, 2 ó 3 ml de sangre que serán desechados. A continuación acoplar la jeringa A para extraer lentamente 40 ml de sangre y posteriormente acoplar la jeringa B para extraer lentamente 15 ml de sangre.
Para obtener un buen rendimiento de marcaje y buena calidad de imágenes, es aconsejable disponer de un número de plaquetas superior a 1010, para lo cual es necesario conocer previamente la cifra de plaquetas del paciente. En caso de plaquetopenia deberá extraerse más sangre en otra jeringa con el anticoagulante A. La relación entre mililitros de sangre y mililitros de anticoagulante A debe ser igual a 5,7 con objeto de alcanzar un pH de aproximadamente 6,5.
Si se desea conocer la recuperación plaquetaria in vitro, extraer también una muestra de sangre en un tubo para hemograma.
Depositar la sangre de la jeringa A en un tubo de poliestireno de 50 ml, de fondo cónico y tapón de rosca (tubo A), sin formar espuma.
Depositar la sangre de la jeringa B en un tubo de poliestireno de 30 ml, de fondo cónico y tapón de rosca, sin formar espuma.
- Dejar reposar el tubo A durante 15 min.
Centrifugar el tubo B a 2000 · g durante 10 min. El plasma libre de células (PLC) resultante, se utilizará para la resuspensión final.
Centrifugar el tubo A a 180 · g durante 15 min.
- Transferir el plasma rico en plaquetas (PRP) del tubo A, con la ayuda de una pipeta de plástico, a un tubo de poliestireno de 30 ml, de fondo cónico y tapón de rosca (tubo A’).
- Centrifugar el tubo A’ a 640 · g durante 10 min. Centrifugaciones más rápidas, hasta 1000 · g, proporcionarían mayor recuperación de plaquetas pero a su vez aumentaría el riesgo de una disminución de su capacidad de agregación.
- Extraer el sobrenadante, plasma pobre en plaquetas (PPP) y conservarlo a 37 ºC para su utilización posterior.
- Lavar el precipitado plaquetario 2 veces de la siguiente forma: deslizar cuidadosamente por la pared del tubo 2 ml de Solución modificada de Tyrode (SMT) mantenida a 37 ºC. Durante unos 10 segundos mover suavemente el fondo del tubo haciendo círculos alrededor de su eje sin alterar el precipitado. Extraer el líquido sobrenadante con una pipeta de plástico.
- Resuspender las plaquetas, sin formar espuma, con 4 ml de SMT a 37 ºC, removiéndolas por aspiración suave con una pipeta de plástico.
Preparar la cantidad requerida de 111In-oxina, diluyendo 4 veces su volumen con SMT a 37 ºC. Añadirla, gota a gota, sobre la suspensión de plaquetas. Agitar el tubo suavemente.
La actividad de 111In-oxina requerida dependerá del tipo de estudio o prueba a realizar. Para el estudio de la supervivencia plaquetaria se recomienda utilizar una actividad máxima de 7,4 MBq.
- Incubar 10 min a 37 ºC.
- Añadir 4 ml del PPP. Centrifugar a 640 · g durante 10 min.
- Extraer el plasma sobrenadante que contiene la actividad no ligada a las plaquetas y reservarlo para calcular la eficiencia del marcaje.
Resuspender las plaquetas marcadas con 5 ml de PLC.
Si la presencia de hematíes marcados no afecta a la calidad de la exploración, aspirar la suspensión de plaquetas marcadas con una jeringa de 10 ml y aguja de 19 G.
Medir su actividad. Si se realiza un estudio de la supervivencia plaquetaria, deben realizarse los pasos 16 y 17 para obtener plaquetas marcadas libres de hematíes marcados.
- Centrifugar a 100 · g durante 3 min con objeto de precipitar los hematíes contaminantes.
Aspirar la suspensión de plaquetas marcadas, sin arrastar los hematíes del fondo del tubo, con la ayuda de una jeringa de 10 ml y aguja de 19 G. Medir su actividad.
Si se desea determinar la recuperación in vitro de las plaquetas, realizar un hemograma con aproximadamente 0,5 ml de la suspensión de plaquetas marcadas y con la sangre extraída inicialmente.
Si se desea efectuar un estudio de la capacidad de agregación, separar también aproximadamente 1,0 ml de la suspensión de plaquetas marcadas.
Si se desea determinar la recuperación plaquetaria in vivo, separar 0,5 ml de la suspensión de plaquetas marcadas en una jeringa de 1 ml.
- Inyectar la suspensión de plaquetas marcadas lentamente, sin lavar la jeringa con la sangre del paciente.
- Efectuar los cálculos del rendimiento de marcaje.
Reactivos
Anticoagulante A
Disolver 25,0 g de citrato de sodio R y 14,9 g de ácido cítrico · H2O R en agua para preparaciones inyectables R hasta un volumen de 1000 ml. Esterilizar por filtración utilizando filtros de 0,22 µm de diámetro de poro. El pH resultante debe ser de 4,5.
Anticoagulante B
Disolver entre 38,0 y 42,0 g de citrato de sodio R en agua para preparaciones inyectables R hasta un volumen de 1000 ml. Esterilizar por filtración, utilizando filtros de 0,22 µm de diámetro de poro.
Solución modificada de Tyrode
Disolver 15,2 g de NaOH R, 26,8 g de ácido cítrico · H2O R, 160 g de NaCl R, 4 g de KCl R, 8,64 g de MgCl2 · 6 H2O R y 20 g de glucosa en agua para preparaciones inyectables R hasta un volumen de 1000 ml. Esterilizar por filtración utilizando filtros de 0,22 µm de diámetro de poro. El pH resultante debe ser de 5,5. Guardar alícuotas a -20ºC. Preparar cada 3 meses.
Un mililitro de esta solución se descongela y diluye, inmediatamente antes de su utilización, a 20 ml con agua para preparaciones inyectables R a 37 ºC para obtener una solución final de pH 6,5 y una osmolaridad comprendida entre 290 y 310 mOsm/kg.