MARCAJE DE LEUCOCITOS CON TECNECIO (99mTc) EXAMETAZIMA (HM-PAO).

Última actualización: 27/05/2010

PROCEDIMIENTO:

  1. Utilizar dos jeringas A y B, conteniendo 4 ml y 2 ml de ACD-A R respectivamente.

    Con ayuda de una palomita de 19 G, extraer sangre en las dos jeringas: en la jeringa A, aproximadamente 30 ml y en la jeringa B, aproximadamente 15 ml. Mezclar suavemente el contenido de cada jeringa.

    • Es aconsejable obtener un número de células superior a 2 · 108 para obtener buenos rendimientos de marcaje y buena calidad de imágenes. Conviene, por tanto, conocer la cifra de leucocitos del paciente para extraer más sangre en caso de leucopenia. La relación mililitros de sangre y mililitros de ACD-A R debe ser igual a 7.5.
    • En lugar de ACD-A R se puede utilizar heparina R sin conservador, a razón de 10 U.I./ml de sangre.

    Si se desea conocer la recuperación celular in vitro extraer también sangre en tubo para realizar un hemograma.

  2. Introducir 8 ml de hidroxietilalmidón al 6% en la jeringa A sin formar espuma. Mezclar suavemente. Dejar la jeringa en posición vertical durante 1 h aproximadamente, a temperatura ambiente, para que sedimenten los hematies y se obtenga un plasma rico en células (PRC). Colocar una palomita de 19 G en la jeringa.
    • Según la velocidad de sedimentación globular, el tiempo necesario para la sedimentación puede variar de 30 min. a 75 min.
    • Se pueden utilizar cantidades inferiores de hidroxietilalmidón al 6%, por ejemplo de 4ml a 6 ml.
  3. Centrifugar la jeringa B a 2.000 · g durante 15 min. El plasma libre de células (PLC) resultante se utilizará para el marcaje y la resuspensión final.
  4. Sin alterar la posición vertical de la jeringa A y deslizando suavemente el émbolo, pasar el sobrenadante que contiene el PRC a un tubo tipo Falcon de 50 ml evitando la contaminación hemática.
  5. Centrifugar el PRC a 150 · g durante 5 min.
    • Centrifugaciones más rápidas, hasta 250 · g, proporcionarían mayor recuperación de leucocitos pero a su vez una mayor contaminación plaquetaria.
  6. Extraer el plasma sobrenadante y reservarlo para posterior utilización. Resuspender el botón leucocitario con 1 ml de PLC, removiéndolo por aspiración suave con una pipeta de plástico.
    • La resuspensión de los leucocitos se puede hacer con menor cantidad de PLC, por ejemplo, 0,5 ml.
    • La resuspensión de los leucocitos en disolución salina fisiológica, en lugar de plasma, aumenta considerablemente el rendimiento de marcaje pero puede disminuir la viabilidad de las células.
  7. Añadir 1 ml de 99mTc-HM-PAO que contenga una actividad inferior a 740 MBq. Agitar el tubo suavemente.
    • La adición del 99mTc HM-PAO a los leucocitos debe de efectuarse lo más rápidamente posible, tras la preparación, ya que se forman cantidades crecientes de tecnecio libre y un complejo secundario no lipófilo en función del tiempo. Un retraso en la adición acarrearía un descenso considerable del rendimiento de marcaje.
    • Se recomienda efectuar el marcaje en un medio al 50 % plasmático. Una vez suspendido los leucocitos en 0,5 ml de PLC, se añadirán 0.5 ml de 99mTc-HM-PAO. Al disminuir el volumen de la suspensión celular se incrementa el rendimiento de marcaje.
  8. Incubar 15 min. a 37 ºC.
    • Se puede incubar a temperatura ambiente. No obstante, es preferible incubar a 37 ºC. Tiempos de incubación de hasta 30 min no afectan a la viabilidad celular.
  9. Centrifugar a 150 · g durante 5 min y extraer el sobrenadante que contiene la actividad no ligada a las células. Reservarlo para calcular la eficiencia del marcaje.
    • Para aquellas incubaciones realizadas con pequeños volumenes de suspensión celular es aconsejable diluir, antes de la centrifugación, con PLC para conseguir una mejor separación de la actividad no ligada a las células.
  10. Lavar con 1 ml de PLC, que se hace deslizar cuidadosamente por la pared del tubo, para evitar que se disperse el botón de leucocitos. Extraer el líquido sobrenadante y reservarlo junto con el extraido anteriormente, para calcular la eficiencia de marcaje.
  11. Resuspender el botón leucocitario con 5 ml de PLC y medir la actividad.
    • Si se desea determinar la recuperación in vitro de leucocitos, realizar hemogramas con aproximadamente 0.5 ml de la suspensión anterior y con la sangre extraida inicialmente.
    • Si se desea efectuar el estudio de viabilidad con Azul de Trypan, separar también 50 µl de suspensión celular marcada
  12. Colocar aproximadamente 4 ml de la resuspensión celular marcada en una jeringa para inyección y medir su actividad.
    • Si se desea determinar la recuperación celular in vivo de los leucocitos, preparar una jeringa estandard con un volumen de pertecnetato igual al de la dosis a inyectar y del mismo orden de magnitud de actividad. Medir la actividad de la jeringa standard.
  13. Inyectar lentamente.
    • Para determinar la recuperación celular in vivo de los leucocitos, extraer aproximadamente 2 ml de sangre a los 30 min y 60 min de la inyección.
  14. Efectuar los cálculos del rendimiento de marcaje.
    • Determinar la recuperación celular in vitro e in vivo y la viabilidad celular.
    • Para el cálculo de la recuperación in vivo se precisa conocer la volemia del paciente. Esta se puede determinar utilizando una disolución inyectable de albúmina humana marcada con iodo (125I) o bien hematies autólogos marcados con cromo (51Cr). No obstante, si no se requiere excesiva precisión, puede estimarse por cálculo teórico a partir del peso y la talla del paciente.

CONTROL DE CALIDAD DEL 99mTc HM-PAO

Pureza radioquímica.

  • Método de extracción con cloroformo.

    Colocar 3 ml de cloroformo R y 3 ml de cloruro de sodio R al 0.9% en un tubo de cristal de 10 ml. Añadir aproximadamente 100 µl de 99mTc HM-PAO. Tapar el tubo y agitarlo durante 1 min. Dejar reposar hasta la aparición de dos fases.

    Separar la fase superior acuosa con la ayuda de una pipeta de vidrio y colocarla en otro tubo de vidrio.

    Medir la actividad de las dos fases utilizando un activímetro. El complejo 99mTc HM-PAO quedará en la fracción de cloroformo.

    Determinar la pureza radioquímica aplicando la siguiente fórmula:

    pureza radioquímica=(Actividad fase inferior x 100)/(Actividad fase inferior + Actividad fase superior)

  • Método cromatográfico.

    Seguir las instrucciones del fabricante, indicadas en la ficha técnica del producto.

CONTROL DE CALIDAD DE LEUCOCITOS MARCADOS

Estudio de viabilidad con azul de Trypan

Centrifugar 50 µl de la suspensión de leucocitos marcados a 150 · g durante 5 min.

Extraer el líquido sobrenadante y resuspender el botón leucocitario con 50 m l de disolución fisiológica tamponada a pH 7,2.

Mezclar 10 m l de la suspensión tamponada de leucocitos marcados con 10 m l de Azul de Trypan.

Colocar 10 µl de la suspensión final en un porta y cubrirlo con un cubre. Antes de 5 minutos, contar los leucocitos viables y no viables entre un total mínimo de 100, en un microscopio óptico.

Se consideran leucocitos viables, aquellos que muestran ausencia de captación del colorante.

Se consideran leucocitos no viables, aquellos que quedan teñidos de azul claro.

Porcentaje de viabilidad=nº de leucocitos viables por cada 100 leucocitos

Normalmente ese porcentaje es superior al 95%)

Aplicar este porcentaje al nº de leucocitos totales para deducir el nº de leucocitos viables.

REACTIVOS

Acido-citrato-dextrosa, fórmula A (ACD - A)

Ver monografía "anticoagulantes y conservantes para sangre humana, disoluciones de", nº 209, pág. 439 de la 1ª edición de la R.F.E.

Hidroxietilalmidón al 6%

Disolver 6.0 g de hidroxietilalmidón cuyo peso molecular promedio sea de 450000, con un grado de sustitución de 0,7 y 0,9 g de cloruro de sodio en 100 ml de agua para preparaciones inyectables R . La disolución debe tener una Osmolalidad de 310 mOsm/kg y un pH entre 5 y 7. Esterilizar por filtración utilizando filtros cuyos poros tengan un diámetro de 0.22 µm.

Azul de Trypan

Disolver 1 g de azul de trypan (C.I. 23850) en 100 ml de agua destilada R. Tomar 1 ml de esta disolución y añadirle 5 ml de disolución fisiológica tamponada a pH 7,2.

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